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非标记小分子筛选蛋白靶标技术
发布时间：2023-11-30 13:44 | 点击次数：
技术名称: MAPP(Metabolite Protein binding Profiling)
技术原理：在 native 状态下提取蛋白，将小分子与细胞裂解液进行孵育，此时小分子与可相互作用的蛋白结合，相对应的， 对照组处理下相同的蛋白没有被小分子结合；被小分子结合的蛋白在结合区域形成了保护；后续对蛋白进行限制性酶切，被小分子结合的蛋白由于被保护可以免于酶切，对照组则会被酶切，后续通过常规的蛋白组处理流程，并利用非标记定量蛋白组技术定量差异肽段，从而找到可能与小分子结合的蛋白。
技术原理如下图：
图 1. 限制性酶切质谱原理
A. 蛋白裂解液（细胞、组织等）分成小分子处理组和对照组，蛋白裂解液与小分子孵育为处理组，随后，进行限制性酶切，由于小分子与靶点蛋白结合保护结合区域不被 pk 酶切，对照组靶点蛋白相应位置被酶切。B. FREE: 对照组，该肽段中间有一个 PK 酶切位点，未受到小分子保护, 酶切后产生两条肽段，BOUND: 小分子处理组，小分子结合后，该位置没有被酶切，R47-R67 整条肽段完整保留。
C. 上图：显示的是 FREE 对照组肽段定量结果，通过定量可以看到两条酶切后的肽段，相比小分子处理组，N48-R56，M57-R67 肽段的定量值高于小分子处理组；下图：显示的是 BOUND 组小分子处理组的肽段定量结果，可以定量到 N48-R67 这条完整肽段，相比对照组，N48-R67 定量值高于对照组。
参考文献：
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Piazza, Ilaria, Kochanowski, et al. A Map of Protein-Metabolite Interactions Reveals Principles of Chemical Communication[J]. Cell, 2018. DOI: 10.1016 /j.cell. 2017.12.006.
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Chen S, Liu X, Peng C, et al. The phytochemical hyperforin triggers thermogenesis in adipose tissue via a Dlat-AMPK signaling axis to curb obesity[J].Cell Metabolism, 2021, 33(3):565-580.e7.DOI:10.1016/j.cmet.2021.02.007.
技术优势：
1. ABPP (Activity-Based Protein Profiling) 技术, 必须先对小分子进行结构改造，对实验顺利开展造成较大困难，改造后的小分子的性质改变，且因分子结构改造可能造成小分子与目标蛋白结合改变；相对应来说，MAPP 实验设计简单，不需要对小分子进行任何改造。
2. 蛋白芯片技术，蛋白芯片技术也可用于小分子蛋白靶标发现，其原理与 ABPP 相似也是基于小分子与蛋白的亲和力实现的，不同的是蛋白芯片技术能在一张芯片上面展示 2w+蛋白，与小分子有亲和力的蛋白能显色。因此，蛋白芯片技术的实现同样要对小分子进行结构改造。
3. DARTS（Drug Affinity Responsive Target Stability assay）技术，该技术与 MAPP 技术类似，都需要做一步限制性酶切，但是 DARTS 技术后续对结果的读取是用质谱技术鉴定胶条，与高通量的蛋白组技术相比，传统的胶条鉴定方法通量低、
重复性差等问题，MAPP 技术来源于 DARTS 技术，但比 DARTS 技术通量高、重复性高等优势。
4. TPP（Thermal Proteome Profiling）技术，该技术对小分子处理后的蛋白混合物在一系列的温度梯度处理下蛋白稳定性的改变这一原理寻找蛋白靶点。该技术能实现对小分子可能靶点的深度鉴定。但是该实验设计、操作流程非常复杂，且要用到昂贵的标记试剂对一系列温度梯度处理下稳定的蛋白进行标记，结果的读取也相对较为复杂。
（参考文献：Christian S. Lentz., et,al., Nat Chem Biol.; 2018; 14(6): 609–617）
2. 蛋白芯片技术，蛋白芯片技术也可用于小分子蛋白靶标发现，其原理与 ABPP 相似也是基于小分子与蛋白的亲和力实现的，不同的是蛋白芯片技术能在一张芯片上面展示 2w+蛋白，与小分子有亲和力的蛋白能显色。因此，蛋白芯片技术的实现同样要对小分子进行结构改造。
（参考文献：Systematic identification of arsenic-binding proteins reveals that hexokinase-2 is inhibited by arsenic）
3. DARTS（Drug Affinity Responsive Target Stability assay）技术，该技术与 MAPP 技术类似，都需要做一步限制性酶切，但是 DARTS 技术后续对结果的读取是用质谱技术鉴定胶条，与高通量的蛋白组技术相比，传统的胶条鉴定方法通量低、
重复性差等问题，MAPP 技术来源于 DARTS 技术，但比 DARTS 技术通量高、重复性高等优势。
（参考文献：Brett Lomenick et al., PNAS, 2009; 106(51), 21984–21989）
4. TPP（Thermal Proteome Profiling）技术，该技术对小分子处理后的蛋白混合物在一系列的温度梯度处理下蛋白稳定性的改变这一原理寻找蛋白靶点。该技术能实现对小分子可能靶点的深度鉴定。但是该实验设计、操作流程非常复杂，且要用到昂贵的标记试剂对一系列温度梯度处理下稳定的蛋白进行标记，结果的读取也相对较为复杂。
（参考文献：Savitski et al., Science, 2014; 346 ）
