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公司新闻
实用！CRISPR/Cas9 系统运用实例分析（下）
发布时间：2020-01-19 11:08 | 点击次数：
CRISPR 多重激活系统介导星形胶质细胞在体转化功能性神经元
2018 年 1 月 15 日，中国科学院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组与上海科技大学黄鹏羽实验室合作完成题为《利用 CRISPR/dCas9 转基因小鼠在脑内进行多基因的同时激活》研究论文并发表于《自然-神经科学》。该研究建立了一种高效的基于 CRISPR/dCas9 的体内激活平台，并且在小鼠脑中实现了包括基因和长链非编码 RNA 在内的多个基因元件的同时激活。该体内激活系统的建立将会为在脑内研究复杂的基因网络以及获得性的表型提供重要的技术手段。
图片来自 Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):440-446. doi: 10.1038/s41593-017-0060-6. Epub 2018 Jan 15
研究人员首先将 SunTag-p65-HSF1 (SPH) 转录激活复合物融合到 dCas9 蛋白上并在人和小鼠的细胞里分别验证了 dCas9-SPH 系统相比以往的转录激活系统更为有效及特异。接着在 Cre 重组酶调控的 dCas9-SPH 转基因小鼠原代细胞里导入 sgRNA 激活基因和长链非编码 RNA 的可行性。实验人员进一步向 dCas9-SPH 转基因小鼠脑部定点注射靶向三个转录因子（ANN）Ascl1，Neurog2、Neurod1 的 AAV-sgRNA，结果显示 ANN 转录因子显著上调，星形胶质细胞可以直接被转化为功能性神经元。此外如果注射靶向多个基因以及长链非编码 RNA 的 AAV-sgRNA 阵列，可实现多个基因在神经元内的同时激活。
该研究证明了可以利用 SPH 小鼠在脑内实现复杂基因网络的调节，并为拓展筛选哺乳动物大脑获得性功能表型提供了新的技术方法。
整合全基因组 CRISPRa 方法使 lncRNAs 在药物耐药中发挥作用
2018 年 4 月 19 日 Cell 期刊上发表了美国哈佛医学院癌症遗传学家 Pier Paolo Pandolfi 实验室的最新研究，论文标题为「An Integrated Genome-wide CRISPRa approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance」。研究人员开发出一种新方法来鉴定和确定 lncRNA 在急性髓细胞白血病（AML）对化疗药物产生耐药性中所起的功能作用。这种新技术将来自公开可获得的药理学数据库的信息与前沿的 CRISPR 技术相结合，筛选影响治疗反应的编码基因和非编码基因。总而言之，这种全基因组筛查平台可用于鉴定和确定与许多健康情况相关的 lncRNA 的功能。
图片来自 Cell. 2018 Apr 19;173(3):649-664.e20. doi: 10.1016/j.cell.2018.03.052.
阿糖胞苷 (Cytarabine，Ara-C) 是一种治疗 AML 的药物，然而 30%～50% 的 AML 患者会产生耐药性，并且机制不明。研究人员将两个公开数据库：癌症靶点发现与开发（Cancer Target Discovery and Development）数据库和癌细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia）数据库的信息构建「有功能的 mRNA、lncRNA 的 CRISPR 文库 sgRNA」，通过「随机激活 lncRNA、mRNA 的转录表达」的方式，筛选针对 760 种不同的细胞系对阿糖胞苷的敏感性和耐药性相关 RNA。对文库转染的亚克隆细胞系分别培养，并使用 Ara-C 进行耐药筛选，存活下来并且增殖的细胞中，被激活的基因或者 lncRNA 被认为和耐药有关，会被富集出来，于是对这些存活的细胞进行 RNA-seq，分析差异表达的 mRNA 和 lncRNA。最后发现 lncRNA GAS6-AS2 的激活，会介导耐药的产生。
这一技术的意义在于允许研究人员一次分析成千上万个编码基因和 lncRNA，并可激活感兴趣的基因，利用阿糖胞苷处理细胞来观察起影响。因此，通过操纵编码基因或是非编码基因的表达来测试它对不同药物敏感性的影响能够鉴定出新的治疗靶标，借助 CRISPR 技术使得我们能够利用每种药物开展类似的研究，高效整合验证多个数据库。
纵观 CRISPR 技术在罕见病治疗、内源基因激活和药敏基因筛选方面的运用， CRISPR 系统拥有诸多优势：
1. CRISPR 调节基因组表达中的作用
基因表达降低（Knockdown）：适用于编码和非编码基因，与 CRISPR-KO 或 RNAi 互补；
基因过表达（Overexpression）：适用于编码和非编码基因。可实现基因在内源环境中过表达；
基因定位：dCas9 与荧光蛋白融合表达，可以对靶基因所在的染色体定位进行示踪；
高通量遗传筛选：利用 CRISPRi/CRISPRa 寻找目的细胞中的易感基因、通路调节关键基因以及组织发育或细胞分化中的重要基因等等。
2. CRISPR 调节基因组的优势
1）dCas9 介导的基因调控可逆，非永久性修饰基因组 DNA；
2）CRISPR 抑制或者激活转录复合物需靶向结合在目的基因转录起始位点，降低了脱靶效应；
3）通过设计多条 gRNAs 可同时对多个靶基因进行调控；
CRISPRi 的作用类似于 RNAi，但又不同于 RNAi。RNAi 针对成熟的 RNA，而 CRISPRi 则是在 DNA 水平阻止转录的起始。与 RNAi 相比，CRISPRi 可靶向 lncRNA、microRNA、反向转录产物、细胞核内的转录本等，是研究非蛋白编码基因的有力工具。
3. CRISPR 调节基因组的局限性
1）PAM 序列限制了结合靶序列的数量；
2）染色体状态和修饰可能会影响 dCas9-gRNA 与基因组 DNA 的结合；
3）哺乳动物细胞中，不同基因的 CRISPRi/CRISPRa 的效率差异性较大；
4）当目的基因的靶序列与其它基因重叠，或受双向启动子调节时，CRISPRi/CRISPRa 介导的调控可能会影响周边的基因表达。
服务内容：
1）课题设计，合成引物
2）CRISPR/Cas9 质粒构建
3）sgRNA 活性检测
4）打靶载体构建
5）CRISPR/Cas9 体外转录制备 mRNA Crispr/Cas 技术途径及原理
产品目录：
√ 细胞系基因编辑
1）基因定制敲除
2）定制细胞系全基因敲除
√ sgRNA 基因功能分选文库（激酶、磷酸化酶/肿瘤凋亡/应激与蛋白降解/膜蛋白与分泌蛋白/线粒体与转运/基因过表达）及高通量筛选验证
1）sgRNA 基因功能分选文库
2）细胞模型高通量筛选
3）新药筛选、药靶筛选及精准医疗医学课题研究
参考文献：
1、Yang S1, Chang R1,2,3, Yang H1 CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse model of Huntington's disease. J Clin Invest. 2017 Jun 30;127(7):2719-2724. doi: 10.1172/JCI92087. Epub 2017 Jun 19.
2、Liao HK1, Hatanaka F1, Araoka T. In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation. Cell. 2017 Dec 14;171(7):1495-1507.e15. doi: 10.1016/j.cell.2017.10.025. Epub 2017 Dec 7.
3、Zhou H1, Liu J2,3,4, Zhou C. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):440-446. doi: 10.1038/s41593-017-0060-6. Epub 2018 Jan 15.
4、Bester AC1, Lee JD1, Chavez A2. An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance. Cell. 2018 Apr 19;173(3):649-664.e20. doi: 10.1016/j.cell.2018.03.052.
这一技术的意义在于允许研究人员一次分析成千上万个编码基因和 lncRNA，并可激活感兴趣的基因，利用阿糖胞苷处理细胞来观察起影响。因此，通过操纵编码基因或是非编码基因的表达来测试它对不同药物敏感性的影响能够鉴定出新的治疗靶标，借助 CRISPR 技术使得我们能够利用每种药物开展类似的研究，高效整合验证多个数据库。
纵观 CRISPR 技术在罕见病治疗、内源基因激活和药敏基因筛选方面的运用， CRISPR 系统拥有诸多优势：
1. CRISPR 调节基因组表达中的作用
基因表达降低（Knockdown）：适用于编码和非编码基因，与 CRISPR-KO 或 RNAi 互补；
基因过表达（Overexpression）：适用于编码和非编码基因。可实现基因在内源环境中过表达；
基因定位：dCas9 与荧光蛋白融合表达，可以对靶基因所在的染色体定位进行示踪；
高通量遗传筛选：利用 CRISPRi/CRISPRa 寻找目的细胞中的易感基因、通路调节关键基因以及组织发育或细胞分化中的重要基因等等。
2. CRISPR 调节基因组的优势
1）dCas9 介导的基因调控可逆，非永久性修饰基因组 DNA；
2）CRISPR 抑制或者激活转录复合物需靶向结合在目的基因转录起始位点，降低了脱靶效应；
3）通过设计多条 gRNAs 可同时对多个靶基因进行调控；
CRISPRi 的作用类似于 RNAi，但又不同于 RNAi。RNAi 针对成熟的 RNA，而 CRISPRi 则是在 DNA 水平阻止转录的起始。与 RNAi 相比，CRISPRi 可靶向 lncRNA、microRNA、反向转录产物、细胞核内的转录本等，是研究非蛋白编码基因的有力工具。
3. CRISPR 调节基因组的局限性
1）PAM 序列限制了结合靶序列的数量；
2）染色体状态和修饰可能会影响 dCas9-gRNA 与基因组 DNA 的结合；
3）哺乳动物细胞中，不同基因的 CRISPRi/CRISPRa 的效率差异性较大；
4）当目的基因的靶序列与其它基因重叠，或受双向启动子调节时，CRISPRi/CRISPRa 介导的调控可能会影响周边的基因表达。
服务内容：
1）课题设计，合成引物
2）CRISPR/Cas9 质粒构建
3）sgRNA 活性检测
4）打靶载体构建
5）CRISPR/Cas9 体外转录制备 mRNA Crispr/Cas 技术途径及原理
产品目录：
√ 细胞系基因编辑
1）基因定制敲除
2）定制细胞系全基因敲除
√ sgRNA 基因功能分选文库（激酶、磷酸化酶/肿瘤凋亡/应激与蛋白降解/膜蛋白与分泌蛋白/线粒体与转运/基因过表达）及高通量筛选验证
1）sgRNA 基因功能分选文库
2）细胞模型高通量筛选
3）新药筛选、药靶筛选及精准医疗医学课题研究
参考文献：
1、Yang S1, Chang R1,2,3, Yang H1 CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse model of Huntington's disease. J Clin Invest. 2017 Jun 30;127(7):2719-2724. doi: 10.1172/JCI92087. Epub 2017 Jun 19.
2、Liao HK1, Hatanaka F1, Araoka T. In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation. Cell. 2017 Dec 14;171(7):1495-1507.e15. doi: 10.1016/j.cell.2017.10.025. Epub 2017 Dec 7.
3、Zhou H1, Liu J2,3,4, Zhou C. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):440-446. doi: 10.1038/s41593-017-0060-6. Epub 2018 Jan 15.
4、Bester AC1, Lee JD1, Chavez A2. An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance. Cell. 2018 Apr 19;173(3):649-664.e20. doi: 10.1016/j.cell.2018.03.052.