实用！CRISPR/Cas9 系统运用实例分析（上）

CRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences- crispr associated genes）系统是在大多数细菌以及古菌中发现的一种天然免疫系统，可用来对抗病毒以及其他病原体对细菌的入侵。其中 II 型 CRISPR/Cas 免疫系统依赖 Cas9 内切酶家族能够靶向和剪切外源 DNA，是目前使用最广泛的 CRISPR/Cas9 系统。

CRISPR 技术的出现，引领了基因编辑领域爆炸式的发展。如今，更多的工具进一步扩充了 CRISPR-Cas 基因技术，将其从单一的「基因剪刀」 扩展成多功能的「基因工具包」，展示了基于不断扩大的 CRISPR-Cas 系统令人兴奋的应用前景。下面我们来盘点一下 CRISPR/Cas9 技术及其衍生运用领域。


CRISPR/Cas9 基因编辑技术运用于罕见病亨廷顿舞蹈症的治疗

亨廷顿舞蹈症（Huntington's disease, HD）是一种遗传性神经退行性疾病，由编码突变的亨廷顿蛋白（mutant huntingtin, mHTT）的毒性蛋白的基因引起。mHTT 蛋白在脑细胞中形成聚集物，从而导致脑细胞死亡主要症状包括不受控制的运动、平衡问题、情绪波动和认知下降。
 

图片来自 Journal of Clinical Investigation, doi:10.1172/JCI92087
 

2017 年 6 月发表在 Journal of Clinical Investigation 期刊上，论文标题为「CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse model of Huntington’s disease」的一项新的研究中，来自美国埃默里大学医学院、中国科学院和暨南大学的研究人员运用病毒载体运送的 CRISPR/Cas9 至 9 个月大的亨廷顿舞蹈症模式小鼠中并成功切除切脑内细胞中的 mHTT 基因的一部分并在数周后发现 mHTT 蛋白聚集物消除，并且模型小鼠的运动能力得到部分改善。

CRISPR 基因编辑技术的问世，其简洁高效的基因组 DNA 编辑效率，将基因编辑疗法推向了一个新高度。随着技术的不断的发展和完善，利用基因编辑技术治愈人类基因突变的各类罕见病的想法正越来越接近现实。


CRISPR/Cas9 介导体内内源靶向基因激活

2017 年 12 月，美国 Salk 生物研究所 Izpisua Belmonte 团队开发了新的 CRISPR/Cas9 系统，通过反式表观遗传重塑，体内激活内源性靶向基因。其核心在于：首先筛选到了高效的转录激活复合物组合 MS2:P65:HSF1（MPH）；然后设计出包含两个能够招募 MPH 转录激活复合物的 MS2 域以及含有 14bpRNA 的 dgRNA；最终在借助 AAV 病毒作为引导工具的条件下激活靶向基因（大多数 CRISPR-Cas9 技术都使用的标准 20 个核苷酸，而短 sgRNA 仅有 14 或 15 个核苷酸，这就能防止 Cas9 切割 DNA）。因此，此技术能够通过将核酸酶失活 Cas9（dcas9）融合到转录激活复合物，利用单链向导 RNA（sgRNA），能够以不改变 DNA 序列、不产生 DNA 双链断裂的方式，激活靶基因的表达。
 

图片来自 Cell. 2017 Dec 14;171(7):1495-1507.e15. doi: 10.1016/j.cell.2017.10.025. Epub 2017 Dec 7

Izpisua Belmonte 团队用这种技术来治疗糖尿病、肌肉萎缩症和急性肾病的小鼠模型。结果表明，CRISPR/Cas9 介导靶向基因激活可在体内产生可衡量的表型和疾病症状的改善，例如恢复小鼠正常肾功能、诱导小鼠肝细胞分化为胰腺样细胞产生胰岛素、增强小鼠肌肉功能等等。

这一技术的主要特点在于：1）不直接切割 DNA，不造成潜在有害突变的双链断裂；2）补强转录机制，诱导跨表观遗传重构；3）激活内源基因表达产生可观测生理表型改变等，为开发针对人类疾病的靶向表观疗法奠定了新的途径。